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　　美国Bio-Rad伯乐pcr仪常见问题

　　一般为48 h以内，有些于当日电泳检测，大于48 h后带型不规则甚至消失。

　　假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有：

　　①模板核酸的制备；

　　②引物的质量与特异性；

　　③酶的质量；

　　④PCR循环条件。

　　寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　1. 模板：

　　①模板中含有杂蛋白质；

　　②模板中含有Taq酶抑制剂；

　　③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白；

　　④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；

　　⑤模板核酸变性不*。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

　　2. 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　3. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

　　①选定一个好的引物合成单 位。

　　②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

　　③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

　　④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

　　4. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　5. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　6. 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　7. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

　　假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　1. 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。

　　2. 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：

　　①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

　　②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应性使用。

　　③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不*互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：

　　①必要时重新设计引 物。

　　②减低酶量或调换另一来源的酶。

　　③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。

　　④适当提高退火温度或采用二温度点法(93 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸)。

　　出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：

　　①减少酶量，或调换另一来源的酶。

　　②减少dNTP的浓度。

　　③适当降低Mg2+浓 度。

　　④增加模板量，减少循环次数。

　　克隆PCR产物的优条件是什么？

　　插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5 ul 2X连接液, 50 ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10 ul。室温保温1小时，或4 ℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4 ℃过夜。

　　PCR产物是否需要用凝胶纯化？

　　如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

　　如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验

　　（A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

　　（B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1 ug/ul质粒1:100稀释,1 ul用于100 ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000 ul后，用100 ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10 ng DNA，用SOC稀释到1000 ul后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

　　（C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

　　（D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

　　对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

　　（A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4 ℃过夜。

　　（B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

　　（C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

　　（D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。

　　（E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。